肝细胞核因子4α增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型建立及初步应用
丁宁, 张明香
2016, 21(1):
28-33.
摘要
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目的 建立一种肝细胞核因子4α(HNF4α)增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型。方法 从临床获得的急性乙型肝炎患者血清中扩增并克隆HBV全长DNA;手术获得肝组织中提取总RNA,扩增并克隆HNF4α基因cDNA。Bsp QI/ScaI双酶切回收HBV全长DNA,HNF4α基因cDNA定向连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建pcDNA3.1-4α表达载体。将HBV全长DNA1μg/孔,按比例共转染pcDNA3.1-4α(0,0.5μg,1μg)于Hep G2细胞,96 h后检测细胞上清中的HBs Ag、HBeAg和HBVDNA;以0.5μg/1μGpcDNA3.1-4α与HBV全长DNA共转染Hep G2细胞,加入不同浓度LAM(0,100μMol/L)和ETV(0,10μMol/L),评价建立的体外复制模型。结果 1%TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定HBV全长DNA和HNF4α cDNAPCR产物,条带长度为3.2 kb和1.5 kb;目的片段克隆后测序鉴定正确。胶回收HBV全长DNA克隆质粒酶切目的片段,构建的pcDNA3.1-4α表达载体酶切鉴定正确后,测序鉴定。不同浓度比例的pcDNA3.1-4α与HBV全长DNA转染Hep G2细胞后,0μg/1μg组合:HBeAg阴性,HBs Ag阴性,上清HBVDNA载量为103;0.5μg/1μg组合:HBeAg阴性,HBs AGA值从0.1升高到1.99,上清HBVDNA载量从1×103IU/ML升高到4 ×104IU/ML;1μg/1μg组合:HBeAg阴性,HBs AGA值从0.1升高到2.4,上清HBVDNA载量从1×103IU/ML升高到1×105IU/ML;LAM从0~100μMol/L,细胞上清HBVDNA降低了97.6%;ETV从0~10μMol/L,上清HBVDNA降低了99.0%。结论 HNF4α增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型,可以体外评价临床常用抗病毒药物,为后续HBV研究提供新思路。